糞便中のＡ型肝炎ウイルスの検査

愛知県においては1989年〜91年にかけてＡ型肝炎の小流行があり､年間 100名以上の患者の報告があった。それ以降数は減ったものの毎年２桁台の報告数が続いている。当研究所では､糞便中のＡ型肝炎ウイルス(HAV)検査に ELISAと抗原捕捉RT-PCR法を用いているので､その概要を報告する。いずれの場合もデンカ生研のHAT-EIAキットを応用している。

糞便は PBSで10％乳剤とした後､10,000×g､20分間遠心分離し､上清を検査材料とする。キット添付の抗HAV抗体がコートされたプレートのブロック液を抜き､洗浄後に検査材料 0.1mlを加え４℃で一晩静置し､翌日検体を除去して洗浄する。ELISAの場合は以後､HRPOラベル抗HAV抗体を反応させ､添付のマニュアル通りに発色させて判定する。

抗原捕捉RT-PCR法の場合は､検体を除去して洗浄後､尿素溶液(７M Urea､0.35M NaCl､10mM Tris-HCl pH 7.4､10mM EDT A､10％SDS) 0.1mlを加えて､室温で10分置く。ウイルスが溶出されるので､この液に0.4mg/mlグリコーゲン加TE液 0.1mlを加えた後､フェノールクロロホルム抽出､およびエタノール沈殿にてウイルスRNA を回収する。これにマイナスプライマー(5'- CCAAGAAACCTTCATTATTTCATG-3') 2μM加HB液(50mM Tris-HCl pH8.3､100mM KCl)11μlを加え 100℃で２分加熱後37℃に10分置く。これに逆転写酵素の反応液10μlを加えて42℃で１時間反応させる。PCR反応はこの全量に､等量のプラスプライマー(5'-ATTCAGATTAGACTGCCTTGGTA-3')を加えたPCR液で94℃15秒､50℃20秒､72℃１分の反応(GeneAmp PCR system 9600を用いる場合)を40サイクル行い､498bpのDNA増幅をアガロースゲル電気泳働で確認している。このプライマーはHAV遺伝子のVP1領域の下流309塩基と2A領域の上流 189塩基を増幅するもので､このうちの 168塩基部分の塩基配列(HM175野生株の3024〜3191番目の塩基)を比較して遺伝子型別分類が行われる。

表に68名のＡ型肝炎患者の糞便を調べた結果を示した。ELISAによる陽性者は２名( 2.9％)のみで発症直後に採取されたものであった。これに対し､PCR法による陽性者は42名(62％)と高率で､発症後４週を過ぎても可能であった。これらの塩基配列を調べたところ４件がIIIB型で他の38件はすべてIA型であった。型内での相同性は96％と高いが､大きく５グループに分かれていた。同一家族の感染例は 100％の相同性を示すことや､１グループは中国流行株と非常に良く似たものであることなどから､型内の違いでも分子疫学に応用できると考えられた。すなわち､感染経路の解明に利用できる可能性がある。

ELISAでの抗原検出は､発症直後かそれ以前でないと難しいが､当研究所では､保育園や家庭内に患者が発生した時に患者以外の人を調べて､発症の１〜２週間前あるいは不顕性に終わった４名のHAV抗原陽性者を経験している。発症前から感染を知ることができ､迅速に用いれば有用と考える。

愛知県衛生研究所
山下照夫　都築秀明　栄　賢司　鈴木康元
国立感染症研究所　戸塚敦子　森次保雄

今月の表紙へ戻る

ホームへ戻る