感染症や食中毒の原因菌や感染経路の解析において､ 近年パルスフィールド・ゲル電気泳動(PFGE)が多用されている。この際､ 技術上問題となる現象が､ PFGEを行ってもスメアーになるサンプルがかなりの割合で見られ､ 解析が不可能になるということである。原因としては､ 以前はプロテアーゼＫ耐性のヌクレアーゼを保有している菌株において､ DNAが抽出中に分解するためにPFGEでバンドがスメアーになるという考えがあった1)。しかし､ 近年PFGEの電気泳動に用いるトリス泳動バッファー中において､ 陽極からトリスのラジカル1)ないし過酸化物2)が発生し､ DNAを攻撃して分解することが報告された。そこで､ この現象を解消するために､ トリス泳動バッファーに50μMのチオ尿素を加えるか､ または電気泳動にトリスバッファーの代わりにHEPESバッファーを用いるなどすれば､ DNAの分解を抑えることが可能となる。
我々は､ 以前より腸炎ビブリオ食中毒の原因食品の推定のため､ 患者糞便より分離された菌株と関連食品より分離された菌株の､ 血清型別ならびにPFGEパターンの比較を行ってきた3)。事例を重ねるうちPFGEのバンドパターンがスメアーになる事例に遭遇し､ PFGEによる遺伝子型解析が不可能になるものがあった。そこで､ トリス泳動バッファーにチオ尿素を加えたところ､ PFGEで結果がスメアーになっていた検体において､ バンドパターンを回復することができたので報告する。
材料および方法：用いた腸炎ビブリオ菌株は､ 仙台市内で発生した食中毒３事例において患者ならびに推定原因食品より得られた。すべてO3:K6､ 耐熱性溶血毒(TDH)陽性の腸炎ビブリオ菌株であった(表)。
PFGEは､ 和田昭仁らの方法［第16回日本細菌学会技術講習会､ 腸管出血性大腸菌(EHEC)の分離・同定法､ PFGEによる分子疫学的同定法､ 1997］により行った。なお､ 電気泳動バッファーは､ 0.5×TBEか､ または50μMチオ尿素を加えた0.5×TBEを用いた。電気泳動ゲルは､ これらの電気泳動バッファーに溶解した１％アガロースを用いた。PFGE装置は､ CHEF MAPPER(BIO-RAD Co.)である。電気泳動は､ ６V/cm､ ４〜８sec(linear)､ ９時間後､ ６V/cm､ ８〜50sec(linear)､ 11時間､ 14℃の条件で行った。
結果：解析した事例は３事例で(表)､ 図(Ａ)は0.5×TBE､ (Ｂ)はチオ尿素を加えた0.5×TBEを電気泳動バッファーに用いた結果である。
図(Ａ)に示すように､ 2000(平成12)年度の２事例(表中の事例１および事例２)においては､ Not I処理のレーン７(事例１の食中毒推定原因食品より得られた菌株)ならびにレーン８(事例２の食中毒推定原因食品より得られた菌株)､ またはSfi I処理のレーン14(事例１の食中毒推定原因食品より得られた菌株)ならびにレーン15(事例２の食中毒推定原因食品より得られた菌株)において､ チオ尿素を加えない0.5×TBEを用いた電気泳動により､ 一部スメアーになっているが､ バンドが解読できるパターンが得られた。これに対し､ 2001(平成13)年度の３事例目(表中の事例３)においては､ Not I処理のレーン２(食中毒推定原因食品より得られた菌株)ならびにレーン３〜６(各患者より得られた菌株)､ またはSfi I処理のレーン９(食中毒推定原因食品より得られた菌株)ならびにレーン10〜13(各患者より得られた菌株)のパターンがすべてスメアーとなった。
そこで､ プラグの調整と制限酵素反応は同様の処理を行い､ 50μMチオ尿素を加えた0.5×TBEを電気泳動バッファーに用いてPFGEを行ったところ､ 図(Ｂ)に示すように､ 事例３の検体より得られたすべての菌株においてもDNAのバンドパターンが得られた(レーンの配列は図(Ａ)と同様である)。
以上より､ トリス電気泳動バッファー中に50μMチオ尿素を加えることにより､ 腸炎ビブリオのPFGEにおいてスメアーになる検体のDNAのバンドパターンが回復できることが明らかとなった。その結果､ 事例３の食中毒においても､ 患者ないしは推定原因食品より得られた腸炎ビブリオ菌株のPFGEパターンは同一であることが証明され､ この食品が事例３の食中毒事件の原因となったことが推察された。なお､ 事例３のPFGEパターンは､ 血清型がO3:K6と同一でも､ 事例１､ ２の菌株のパターンとは異なることも明らかとなった。
考察：電気泳動バッファーにトリスを用いずHEPES バッファーを用いる方法も考案されているが､ HEPESは高価で､ PFGEの電気泳動には大量の電気泳動バッファーを用いることから､ あまり実用的ではない。これに対し､ チオ尿素加トリス泳動バッファーを用いる方法は､ 通常のPFGEに用いる0.5×TBEに､ 1,000倍濃度(50mM)のチオ尿素を1,000分の１量加えるだけで､ 経済的にも操作上も実用上問題ない。また､ PFGEの結果スメアーになるのは多くの場合菌株に固有の性質と考えられるが､ その原因は判っていない。
以前に報告のあったPseudomonas aeruginosa 1)やClostridium difficile 4)などと併せて､ 病原大腸菌の菌株においてもDNAのスメアーの回復にチオ尿素加トリス泳動バッファーを用いる方法が有効であった(山形県衛生研究所・大谷､ 私信)。よって､ チオ尿素加トリス泳動バッファー法は､ 病原・環境細菌の菌株の系統や感染経路の解析法としてのPFGEの汎用性を高める上で､ 有用な技術となることが示唆された。
謝辞：PFGEならびにチオ尿素加トリス泳動バッファーを用いたPFGEに関して､ 指導ならびに情報をいただきました､ 国立感染症研究所細菌部・寺嶋 淳先生に深謝致します。
参考文献
１)U. Römling and B. Tummler, J. Clin. Microbiol. 38: 464-465, 2000
２)T. Ray, et al., Electrophoresis 16: 888-894, 1995
３)N. Numata, et al., Jpn. J. Infect. Dis. 53: 75-77, 2000
４)J. E. Corkill, et al., J. Clin. Microbiol. 38: 2791-2792, 2000
仙台市衛生研究所
沼田 昇 齋藤卓哉 小黒美舎子 早川安彦 吉田菊喜
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