堺市基幹定点において、2009年11月18日（第47週）にインフルエンザ迅速検査でＢ型インフルエンザと判定された患者（症例１）検体からリアルタイムRT-PCR法で新型インフルエンザ遺伝子が検出され、同時にＢ型インフルエンザウイルス・山形系統株、が分離された。この症例は大阪府内において、2009/10シーズンの季節性インフルエンザでは初めての分離例である。新型インフルエンザウイルスとＢ型インフルエンザウイルスの重感染の可能性が考えられた。また、12月18日第51週の検体（症例２）でも新型インフルエンザウイルスと同時にＢ型インフルエンザの反応もみられたがウイルス分離は不可能であり、最終的にはＢ型インフルエンザとの結論に至らなかった。
これらの症例の報告とともに検査結果の判読についての一考察を報告する。
症例１：堺市北区在住 4歳 男児 川崎病既往
家庭内感染：なし
臨床経過：2009年10月24日、朝37.5℃であったが、夕方に38.5℃に上昇、近医を受診し、感冒との診断を受けた。25日には37〜38℃の発熱が持続し、咳嗽が増強した。26日には解熱したが、27日夕方より39℃の発熱を認め、28日に基幹定点病院を受診した。熱は37.2℃で、咽頭発赤なく、呼吸音清明で、インフルエンザ迅速検査陰性、WBC 4,410/μl、CRP 2.3 mg/dlで、鎮咳剤のみの投与を受けた。11月2日、37.2℃までの発熱があり、咳嗽は持続していたが症状は軽減していた。9日には咳嗽持続するため、再度基幹定点病院を受診した。咽頭発赤なく、呼吸音清明であったが、10日より微熱が出現し、12日には咳嗽および鼻汁が出現し、発熱も認められた。16日に再受診した。アデノウイルス迅速検査、RSウイルス迅速検査ともに陰性、咽頭発赤なく、呼吸音清明で、鎮咳剤の処方を受けた。17日早朝より39.3℃の発熱があり18日再度受診し、39.6℃の発熱、下痢を認め、咳嗽持続、鼻汁増悪傾向であった。同日のインフルエンザ迅速検査でＢ型インフルエンザと判定されたが、咽頭発赤はなく、心肺所見にも異常はなかった。オセルタミビルの内服を開始し、19日には解熱した。24日の再診時では、咳嗽と軽度の鼻汁が認められたが、咽頭および心肺所見に異常は認められなかった。
インフルエンザ検査：11月18日に採取された咽頭ぬぐい液と鼻汁の混合1検体を用いた。
１） 新型インフルエンザ遺伝子検査
病原体検出マニュアルH1N1新型インフルエンザ(国立感染症研究所2009年11月ver.2)に従ってリアルタイムRT-PCR法による新型インフルエンザ遺伝子検査を行った。Ａ型インフルエンザ共通プライマーでは検出しなかったがswH1検出プライマーではCt（cycle threshold）値41.12で立ち上がりは遅かった。しかし、コンベンショナルRT-PCR法にて得られた遺伝子産物の塩基配列を解析したところ、A/Narita（成田）/1/2009(H1N1)pdmのHA遺伝子領域約350bpに99.1％の相同性が認められ、新型インフルエンザウイルス陽性と判定された。
２）ウイルス分離・同定検査
MDCK細胞にてウイルス分離を実施した。初代培養で4日目からCPEが観察され、0.75％ヒトＯ型赤血球を用いた赤血球凝集（HA）試験では128倍を示した。そこで、ウイルス分離株について国立感染症研究所より配布された2009/10シーズン用インフルエンザウイルス同定キットを用いて、赤血球凝集抑制（HI）試験により型別を行った。分離された株は抗B/Bangladesh/3333/2007血清（ホモ価2,560）に対しHI価1,280、抗B/Brisbane/60/2008血清（同5,120）に対しHI価20を示し、抗A/California/7/2009（H1N1）pdm血清（同5,120）、抗A/Brisbane/59/2007（H1N1）血清（同640）、抗A/Uruguay/716/2007（H3N2）血清（同1,280）ではいずれもHI価＜10であった。また、2008/09シーズン用キットでは抗B/Brisbane/3/2007血清（同10,240）に対しHI価640、抗B/Malaysia/2506/2004血清（同5,120）に対しHI価20であり、山形系統のＢ型インフルエンザウイルスと判定されたが、新型インフルエンザウイルスは分離に至らなかった。
以上の結果から、新型インフルエンザウイルスと山形系統のＢ型インフルエンザウイルスの重感染と推測された。
症例2 : 堺市堺区在住 11歳 男児
家庭内感染：なし
臨床経過：2009年12月16日咳嗽出現、17日早朝より39.6℃の発熱を認めた。同日近医受診、呼吸苦を訴えたが、酸素飽和度は95〜97％であった。その際に、「椅子が動いている」、「体が浮いている」などの異常言動を認めた。インフルエンザ迅速検査にてＡ型弱陽性であったため、基幹定点病院に紹介入院となった。入院時、発熱37.9℃、意識清明であり、身体所見上、眼球結膜の発赤、咽頭の軽度発赤を認めたが、呼吸音清明であり、神経学的異常所見も認められなかった。インフルエンザ迅速検査でＡ型インフルエンザと判定、WBC 5,540/μl、CRP 2.1 mg/dlであり、オセルタミビルの内服を開始した。入院後異常言動や異常行動は認めていない。18日も38℃台の発熱持続、酸素飽和度93％前後まで低下したため、一時的に酸素投与を必要とした。19日昼頃には解熱、酸素飽和度の低下も認めず、同日退院した。12月21日には軽度の咳嗽が残存する程度であった。
インフルエンザ検査：インフルエンザ遺伝子検査は症例1と同様に11月17日に採取された咽頭ぬぐい液と鼻汁の混合１検体についてリアルタイムRT-PCR法を行った。swH1とＢ型およびＡ型共通プライマーいずれも陽性であった。しかし、Ｂ型遺伝子はCt値39.91の立ち上がりを示し、新型（Ct値25.50、Ａ型共通24.22）に比べて遅かった。MDCK細胞を用いてウイルス分離を試みたところ、新型インフルエンザウイルスは分離されたが、Ｂ型は分離不可能であった。
考 察
症例1では、11月18日に採取された検体の検査結果から、Ｂ型インフルエンザウイルスと新型インフルエンザウイルス遺伝子の存在が確認され、両インフルエンザウイルスの重感染の可能性が疑われた。リアルタイムRT-PCR検査のCt値から、新型インフルエンザウイルス量はごく少ないことが想定され、先行感染した新型インフルエンザが沈静化しつつある状態であったのか、あるいは不顕性感染なのか、さらには両ウイルスの重感染にもかかわらず一方のウイルスが淘汰された可能性が推察されたが結論への過程は困難であった。明白なことは、18日の時点ではＢ型インフルエンザが優勢でかつ同日の検体からウイルス分離ができたこと、新型インフルエンザウイルスはコンベンショナルRT-PCR法による遺伝子産物の塩基配列でA/Narita（成田）/1/2009(H1N1)pdmと高い相同性が認められたこと、である。患児は幸いにも重症化することなく、通常のインフルエンザ感染の臨床経過をとった。
一方、行動異常を認めた症例２では、症例１とは逆に、新型インフルエンザウイルスが優位の感染であることが示唆され、ウイルスも分離された。しかし、Ｂ型インフルエンザウイルスはCt値も延長し、ウイルス分離は不可能であった。リアルタイムRT-PCR法に基準を置く遺伝子検査では、Ct値の高い場合にも往々にして陽性判定が下される。このような場合、Ct値を参照しつつウイルス分離を並行するなど慎重な判断が求められる。Ct値35以下の検体では反応特異性を強く示唆する数値であるが、それ以上は非特異的反応の可能性が高いと考えられている(感染研インフルエンザウイルス研究センター・小田切先生コメント)。
堺市におけるＢ型インフルエンザウイルス分離状況を見ると、2008/09シーズンに分離されたＢ型インフルエンザウイルスは25株あり、すべてがVictoria系統であった。今シーズン初のＢ型インフルエンザ分離株は山形系統であったが、2009/10シーズンにはインフルエンザワクチンはVictoria系統が既に選定されており、今後の流行状況に注意する必要がある。
新型インフルエンザと季節性インフルエンザの重感染は症状の重症化の要因となり得るのか、興味の持たれるところであるが、症例１では、基礎疾患があるにもかかわらず重症化には到らなかった。重症化の評価は、今後の症例の蓄積・解析が大切である。
また、当研究所の5月21日〜12月8日までの簡易診断キット測定でＢ型インフルエンザウイルスと判定された18検体はすべてRT-PCR検査でＢ型遺伝子は陰性であったが、そのうち4例から新型インフルエンザウイルス遺伝子が検出されている。新型インフルエンザの流行が減少しつつある中で、季節性インフルエンザのサーベイランスは重要だが、簡易診断キットとRT-PCR法の結果の乖離は、単にキットにその原因を求めるのか、或いは新型インフルエンザウイルス感染による何らかの抗原性の変化が生じているためなのか、今後も慎重に検討しなければならない課題と思われる。
なお、堺市感染症発生動向調査の定点当たりのインフルエンザ患者発生数は、第44週がピークで37.5であった。第47週は23.8、第41週は16.5であった。図には月別のインフルエンザ検出状況を示した。
堺市衛生研究所
内野清子 高橋幸三 三好龍也 松尾光子 狩山雅代 吉田永祥 田中智之
市立堺病院小児科 石井 円 岡村隆行
堺市保健所 藤井史敏 前野敏也
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