保育園児に対するインフルエンザワクチンの予防効果を判定するため，罹患調査の一環として対象園児から積極的なウイルス分離を試みた。われわれはこれまでインフルエンザウイルスの分離に，９日ないし10日令の孵化鶏卵を用いてきたが，今シーズンの流行にＭＤＣＫ細胞および，ＬＬＣＭＫ2細胞を同時に用い，ウイルス分離率の増加を期待した。また，ミクソウイルス以外への分離スペクトルの拡大も併せて狙った。

　対象及び方法

　1981年12月下旬から1982年３月中旬にかけて川崎市内の４ヶ所の保育園の有症状者から採取した146検体を対象とした。咽頭ぬぐい液78検体は主として保母が，鼻腔洗滌液68検体は医師が採取した。検体はウイルス分離に入るまでは−80℃に凍結保存し，その後，９日孵化鶏卵羊膜腔，ＭＤＣＫ細胞，ＬＬＣＭＫ2細胞にそれぞれ接種した。ＭＭＣＫ細胞は10％ウシ新生仔血清加ＭＥＭ，ＬＬＣＭＫ2細胞は５％ウシ新生仔血清加ＭＥＭを用いて培養し，単層形成をまってマイナスＰＢＳで洗滌後検体を0.1mlづつ接種した。室温で30分吸着後ウイルス増殖培地に置きかえた。増殖培地にはイーグルＭＥＭ強化培地（５μg/mlトリプシンを含む）を用い，材料を接種した細胞は37℃のＣＯ2インキュベーターで５〜７日培養し，上清をハーベストした。インフルエンザウイルス分離の指標としては，従来のニワトリ血球凝集反応に加えて，更にNeuraminidase（ＮＡ）活性も測定した*。その際，対照の未感染培養上清の吸光度が，0.05以下であることから，0.1以上のO.D.を一応陽性の目安とした。

結果

　146検体のうち血球凝集（ＨＡ）価が４倍以上のものは，ＭＤＣＫ細胞で30検体（20.6％），ＬＬＣＭＫ2細胞を用いた場合は23検体（15.8％），孵化鶏卵を用いた場合は５検体（3.4％）であった。孵化鶏卵を用いてＨＡ価が４倍以上であった５検体のうち４検体は，ＭＤＣＫ，ＬＬＣＭＫ2両細胞でもＨＡ価は４倍以上であったが，他の１検体はＭＤＣＫ細胞においてのみ４倍以上であった。23検体はすべてＭＤＣＫ細胞を用いた場合も４倍以上の血球凝集活性を示した。

　ＮＡ活性がO.D.0.1以上の陽性検体は，ＭＤＣＫ細胞を用いた場合は40検体（27.4％），ＬＬＣＭＫ2細胞では36検体（24.7％）であった。ＬＬＣＭＫ2細胞を用いて陽性となった36検体のうち２検体はＭＤＣＫ細胞では陰性であった。

　また，ＨＡ価が４倍以上の30検体は１検体を除いてＮＡ活性がすべて陽性であった。

　ＮＡ活性が陽性でＨＡ活性が陰性の10検体のうち，８検体は２代継代した。その結果，１検体からはＭＤＣＫ細胞で血球凝集因子を得た。従って，ＭＤＣＫ細胞に接種して得られた血球凝集因子は31株となった。

　ＭＤＣＫ細胞を用いて４倍以上の血球凝集活性を示した31株を，その採取方法によって比較してみると，鼻腔洗滌液68検体から９株（13.2％），咽頭ぬぐい液78検体からは22株（28.2％）となった。

　31株のうち27株について同定を試みた所，26株がＢ株で，Ａ（Ｈ3Ｎ2）型は１株であった。しかし，Ｈ1Ｎ1型は分離されなかった。なお，孵化鶏卵を用いて分離できた５株のうち４株はＢ型，１株はＡ（Ｈ3Ｎ2）型であった。

　考察

　以上のことは，特に最近のＢ型インフルエンザウイルスの分離に関しては，孵化鶏卵よりもＭＤＣＫ細胞の方が圧倒的に有利であることを示すものであろう。ＬＬＣＭＫ2細胞系もＭＤＣＫ細胞系には多少劣るが，孵化鶏卵を用いる方法よりはすぐれていることがわかった。ウイルス分離用材料の採取に経験のない保母が採取した検体からも相当数のウイルスが分離されたことを考えると，医師による直接的な材料採取は，分離率を更に向上させるものと思われる。ちなみに，同じシーズン中に川崎市立川崎病院小児科外来患児からも孵化鶏卵接種法によりインフルエンザウイルス分離を試みたが，362検体から30株が分離され，分離率は8.3％であった。

　更に今回の研究で，ＮＡ活性を指標にすると分離率の増加がもっと期待できることが示唆された。従って，まずＮＡ活性を指標としてスクリーニングを行い，ＨＡ価が陰性であってもＮＡ活性が陽性あるいは境界線上の検体はめくら継代をすべきであろう。落ちこぼれていくウイルスを再び拾い集めることもできよう。また，ＬＬＣＭＫ2細胞とＮＡ活性を指標にすれば，パラインフルエンザウイルスの分離もまた可能である。これに細胞変性効果の指標を加えればその他のウイルス分離の可能性も拓かれて，上で示したウイルス分離システムの価値は高いものとなろう。

　結論

１．保育園児から採取した146検体を対象としてインフルエンザウイルスの分離を試みた。分離されたインフルエンザウイルスは，Ｂ型が26株，Ａ（Ｈ3Ｎ2）型が１株であった。

２．ＭＤＣＫあるいはＬＬＣＭＫ2細胞系を用いた方が，孵化鶏卵接種法よりも分離率がすぐれていた。

３．ＭＤＣＫ，ＬＬＣＭＫ2両細胞系を用い，ＮＡ活性を指標とすることにより，インフルエンザウイルスの分離率の増加と共にパラインフルエンザウイルスの分離も期待できる。

４．以上の成績は，上記システムがウイルス分離率の向上に功を奏することを示すばかりでなく，ウイルス分離に要する費用と労力の軽減をも果たすものといえよう。

＊根路銘国昭：モダンメディア，20；153-164，1974



川崎市立川崎病院小児科　武内　可尚，渡辺　淳，冨井　郁子
国立予防衛生研究所　ウイルスリケッチア部ウイルス３室


　分離系によるウイルス分離数の比較