遺伝子レベルでのウイルスの型や株の同定が身近なものになって久しいが，特にムンプスウイルスなどのように血清学的には単一であると考えられてきたウイルスの株を特定するには，遺伝子レベルでの解析が強力な武器となる。

　我々はムンプスウイルスの株鑑別に，ウイルスのＰ遺伝子の一部の制限酵素切断パターン（いわゆるＲＦＬＰ）が利用できることをかつて報告したが，これは当時ＭＭＲ統一株に含まれていたムンプスウイルス占部株を迅速に鑑別するための方法であって，現行の５株のムンプスワクチンのうち占部株以外の４株を迅速に鑑別するのには，ここで紹介するＳＳＣＰ（single strand conformation polymorphism）解析によっている。

　ウイルスＲＮＡの調製：感染価の十分にある分離ウイルスであればそのまま用いることができる。ウイルス液に最終濃度で0.1％のピロ炭酸ジエチルならびに0.5％のＮＰ-40を加え，100℃，５分加熱した後，12,000rpm，30秒遠心した上清を粗ＲＮＡとする。感染価が低い場合，あるいは髄液などの患者材料をじかに扱うときは，ＡＧＰＣ法によりＲＮＡを分画する。200μlの検体に500μlの変性試薬（４Ｍグアニジンチオシアネート，25mMクエン酸ナトリウムpH7.0，0.1M　2-メルカプトエタノール，0.5％サルコシル），50μlの２Ｍ酢酸ナトリウム（pH4.0），500μlフェノール，100μlクロロホルムを加え，10〜20秒ボルテックスし，氷上に15分静置，10,000g，20分の遠心上清に等量のイソプロパノールを加え，−20℃，30分静置した後，16,000g，10分遠心する。その沈査を75％エタノールで洗浄した後，少量の滅菌水に溶解する。イソプロパノール沈殿を行う際にキャリアーとしてグリコーゲンを加えてもよい。

ＲＴ-ＰＣＲ：上記ＲＮＡを鋳型としてＲＴ-ＰＣＲを行う。95℃１分加熱，氷中で急冷した10μlのＲＮＡ溶液に４μl ５ｘ ＲＴ緩衝液（250mM Tris-ＨＣＩ，pH8.3，375mM ＫＣＩ，15mM ＭｇＣＩ₂），２μl 10mM ｄＮＴＰ，２μl 0.1M ＤＴＴ，20pmole ５´プライマー，20pmole ３´プライマー，50単位ＲＮase インヒビター，200単位Ｍｏ-ＭｕＬＶ逆転写酵素を加え滅菌水で全量20μlにする。37℃１時間インキュベートした後，８μl 10x Taq緩衝液（700mM トリス塩酸，pH8.8，20mM塩化マグネシウム，１％トリトンＸ-100），２μl 10mM ｄＮＴＰ mix，50pmole ５´プライマー，50pmole ３´プライマー，２単位Taq ＤＮＡポリメラーゼを加え滅菌水で80μlにする。95℃，１分，55℃，２分，70℃，1.5分から成るＰＣＲを20〜25サイクル行う。

　ＳＳＣＰ解析：0.5μlのＰＣＢ産物に１pmoleずつのＸＲＩＴＣ標識５´および３´プライマー，1.0μlの10x Taq緩衝液，1.0μlの200μＭ ｄＮＴＰ，0.2単位のTaq ＤＮＡポリメラーゼを加え，滅菌水で10μlとし，再びＰＣＲを行いＤＮＡを蛍光標識する。その１μlに４μlのホルムアミドを加え94℃，２分加熱した後２μlを５％グリセロールを含む６％ポリアクリルアミドゲル中で20mA／ゲル，1.5時間0.5x ＴＢＥ緩衝液を用いて26±１℃で電気泳動した後，ＦＭ-ＢＩＯ100イメージアナライザーで解析する。

使用するプライマーはすでに報告したＰ９およびＰ10であるが，さらに外側に設定したもの（Pf，Pr）を初回のプライマーに用いても良い。参考までに各プライマーの塩基配列を記しておく。

　　Ｐ９：５´-ＣＴＣＡＴＴＧＧＣＡＡＴＣＣＡＧＡＧＣＡ-３´

　　Ｐ10：５´-ＡＴＧＡＡＣＣＴＧＴＴＧＧＴＴＧＧＡＴＡ-３´

　　Ｐｆ：５´-ＡＡＣＣＡＡＣＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＧＧ-３´

　　Ｐｒ：５´-ＣＴＡＴＣＴＴＡＧＣＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡ-３´

　我々は蛍光標識により解析を行っているが，これはＲＩ施設を使用しないですむからで，ＲＩ標識で行うことも勿論可能である。また，銀染色を施せば特殊なイメージアナライザーは必要ではない。ただし，泳動条件などについては別途検討する必要があることはいうまでもない。



　文　献

Katayama K. et al. : Differentiation of mumps vaccine strains from wild viruses by single-strand conformation polymorphism of the P gene. Vaccine 11: 621-623, 1993



予研ウイルス製剤部　山田　章雄