（本研究は愛知県衛生研究所・栄　賢司，国立予防衛生研究所・武田　直和らとの共同研究である）

1970年〜1991年に手足口病患者から分離されたコクサッキーウイルスＡ16（ＣＡ16）とエンテロウイルス71（ＥＶ71）についてＰＣＲとマイクロプレート・ハイブリダイゼーションを組み合わせて遺伝子型を指標にした型鑑別を行った結果，興味ある結果を得たので報告する。

　遺伝子型を指標にした型鑑別は以下の方法で実施した。臨床分離株のＲＮＡの５´非翻訳領域の一部，ＶＰ４全領域，およびＶＰ２領域の一部を含む約650ｂｐをＲＴ-ＰＣＲで増幅しプローブを作製した。標識ＤＮＡは同様にビオチン標識プライマーを用いて作製し，マイクロプレート固相法（Inouye & Hondo, Arch. Virol., 129: 311-316, 1993）の変法で高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションを行った。判定は同一プローブと標識ＤＮＡの反応時の吸光度を100％とした比率で示した。

1979年〜1991年に愛知県で手足口病患者から分離されたＣＡ16の臨床分離株の型鑑別の結果を表１に示した。臨床分離株は他血清型標準株および1951年に南アフリカで分離されたＣＡ16標準株とは反応しなかった。しかし臨床分離株間ではすべて相互に反応がみられた。この結果は1979〜1991年に愛知県で流行したＣＡ16による手足口病は遺伝学的に極めて近縁のウイルスによって引き起こされたことを示唆している（医学のあゆみVol. 168，1068-1069，1994）。

表２は，1970〜1990年に手足口病患者から分離されたＥＶ71の臨床分離株の型鑑別の結果である。ＣＡ16同様，臨床分離株と他血清型標準株および1970年にアメリカ合衆国で分離されたＥＶ71の標準株との反応はみられない。また，臨床分離株は1986年を境に著しく変化しており，その反応性から1970〜1986年分離株と1989〜1990年分離株の２つのグループに分けることができた。1970〜1986年に愛知県で流行したＥＶ71は遺伝学的に極めて近縁であり，これらのウイルスはまた1986年に台湾で流行したウイルスとも反応がみられた。したがって1970〜1986年までは，遺伝学的に極めて近縁なＥＶ71が愛知県と台湾で流行していたことが示唆される。しかし，これらのウイルスと1989〜1990年分離株とは全く反応せず，1989年以降遺伝学的に全く別系統のＥＶ71が愛知県内で流行したことが示された（同上文献）。事実，ウイルスのＶＰ４領域の塩基配列の一部を解析した結果，1970〜1986年の分離株間でのホモロジーは約94％，1989〜1990年の分離株間では約98％であるのに対し，1986年分離株と1989〜1990年分離株間では約84％であった（臨床とウイルスVol. 22，199-207，1994）。この結果から遺伝子型を指標にした型鑑別の反応性が塩基配列の差を反映したものであることが確認された。このような現象は従来の中和法ではとらえることは困難で，分子生物学的手法によってのみ可能であると考えられる。また本法はハイブリダイゼーションの反応温度を上げるなど，ストリンジェンシーをあげることにより，さらに厳密に塩基配列の差を検出することができ，疫学解析に有用な方法となる可能性が示唆された。現在，さらに広範囲にわたった解析が進行中である。

エンテロウイルスは他のＲＮＡウイルス同様自然界で極めて高速に変異することから，アミノ酸変異を伴った塩基変異がウイルス構造蛋白領域に生じた場合，標準抗血清では同定不可能な難中和性ウイルスが生じる可能性がある。流行株から容易にプローブを作製し，最新の分離株に対処することができる点は，従来の方法にはない本法の利点である。今後エンテロウイルス分離株を迅速に高い精度で同定する本法がエンテロウイルスの生態を明らかにしていく上で大いに利用されることが期待される。



三菱化学ビーシーエル　成澤　忠


表１．ＣＡ16臨床分離株の型鑑別
表２．ＥＶ71臨床分離株の型鑑別